通络药物对心肌细胞钙离子通道的影响

    |     2014年1月26日   |   医学动态   |     2 条评论   |    4079

图1参松养心胶囊对INa的影响 (注:A、B分别是用药前和药物浓度0.5%时记录的INa;C是药物浓度0.5%时对INa最大峰值电流的影响;D是药物对INa电流密度―电压关系的影响。)

中国医学科学院阜外心血管病医院李宁马克娟孙奇浦介麟河北以岭医药集团霍有平

通络药物参松养心胶囊是根据中医络病理论,由人参、麦冬、甘松等12种中药组成的复方制剂,其中多数药物均有较好的抗心律失常作用。有研究报道,参松养心胶囊能明显抑制药物诱发的心律失常,并对缺血再灌注所致心律失常也有明显的保护作用。有随机双盲临床试验显示,参松养心胶囊对治疗冠心病心律失常有明显疗效,但未见对心肌细胞离子通道影响的报道。本研究采用全细胞膜片钳记录技术,探讨了参松养心胶囊对豚鼠单个心室肌细胞离子通道L型钙电流(ICa,L)和钠电流(INa)的影响,了解其作用的电生理机制,为其临床应用进一步提供理论和实验依据。

材料和方法试剂与溶液通络药物对心肌细胞钙离子通道的影响

参松养心胶囊提取干粉,由石家庄以岭药业有限公司提供。所用溶液包括:无钙台(Tyrode)氏液、KB(Krebs Buffer)缓冲液、记录钠电流的细胞外液、记录钠电流的电极内液、记录钙电流的细胞外液、记录钙电流的细胞内液(所有电极内液用0.22μm微孔滤膜过滤)、参松养心胶囊药物溶液。

单个豚鼠心肌细胞的分离

所用动物为成年豚鼠,雌雄不限,体重250~300g。细胞分离方法参照文献方法加以改进,用急性酶解法制备心室肌单个细胞。

将豚鼠用50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,开胸取出心脏,在4℃无钙台氏液中分离主动脉并插管,行朗根多夫(Langendorff)心脏灌流,速度为6~8ml/min。先以无钙台氏液灌流3min,再用低钙酶解液循环灌流约15min,将心脏置入室温KB缓冲液中,剪去心房和基底部的组织,将心室组织轻轻撕拉,缓慢吹打,以获得单个心室肌细胞。将上清液过滤,室温保存备用。

整个灌流系统温度保持在37℃,所有的灌流液和KB缓冲液均通以100%的O2饱和30min以上。

全细胞膜片钳实验记录

吸取少许富含细胞的KB缓冲悬液于灌流槽中,静置5~10min,待细胞附壁后,用100%O2饱和的细胞外液行表面灌流5~10min,流速2~3ml/min。在倒置显微镜(奥林巴斯IX70)下选择边缘清楚、表面光滑、横纹清晰、无收缩的单个细胞进行实验。实验在22~24℃室温下进行。采用哈米尔(Hamill)等的标准全细胞膜片钳记录方法,在电压钳制模式下记录通道电流。膜片钳放大器通过数据转换器同计算机相连接,刺激信号及数据采集均由美国阿克森公司pClampex7.0软件控制。

记录时为避免电流的衰减影响,控制实验在细胞破膜后5~25min内完成。破膜后稳定5min记录给药前的电流值,给药5min后分别记录不同浓度药物作用下的电流值。为消除细胞间误差,电流值以电流密度(pA/pF)表示。各电流刺激方案设定及观察指标

记录INa时的刺激方案:维持电位-100mV,指令电位-100mV~+40mV,阶跃10mV,钳制时间30毫秒(ms),刺激频率0.2Hz,以测试电压-20mV的INa峰值电流密度在用药前后的变化作为观察指标。

记录ICa时的刺激方案:维持电位-70mV,指令电位-60mV~+60mV,阶跃10mV,钳制时间240ms,刺激频率0.2Hz,以测试电压10mV的ICa峰值电流密度在用药前后的变化作为观察指标。

为避免长时间记录时电流衰减现象对实验结果的影响,设立空白对照组,即相同条件下引出INa、ICa,L后,以不含药物的细胞外液灌流,每5min重复实验一次,仍以INa和ICa,L峰值电流密度作为观察指标。

数据分析与统计

原始电流数据采用美国阿克森公司Clampfit8.0软件进行测量,使用美国微软公司Origin6.0数据处理软件对采集后数据进行分析、拟合和作图。实验数据以(均数±标准差)表示,给药前后采用配对t检验。

■摘要

目的观察通络药物参松养心胶囊提取干粉溶液对单个豚鼠心室肌细胞膜钠通道电流(INa)、L型钙通道电流(ICa,L)的影响。

方法用钙外液将参松养心胶囊干粉配制成不同浓度(1%、0.5%、0.25%)。用酶解法分离单个心室肌细胞,并用全细胞膜片钳记录技术记录电流。

结果当药物浓度为0.5%时,可以使INa峰值电流密度从(27.2±5.4)pA/pF降至(14.9±2.8)pA/pF,平均抑制率为44.8%±7.7%(n=5,P<0.05);药物浓度为1%、0.5%、0.25%时,对ICa,L的峰值电流密度的抑制率分别为50.7%±5.6%、44.8%±6.5%和19.2%±1.1%(n=5,P<0.05)。药物可以使INa、ICa,L的电流密度―电压曲线上移,但均不改变其激活、峰值和反转电位。

结论参松养心胶囊提取干粉溶液对INa、ICa,L具有阻滞作用,这可能是其抗心律失常和心肌保护作用药理机制的一部分。结果参松养心胶囊对豚鼠心肌细胞膜INa的作用

使用INa细胞内外液和刺激方案,在豚鼠心室肌细胞上能记录到一快速激活、快速失活的内向电流。膜电位从-50mV开始激活,峰值电位在-20mV左右,反转电位+20mV左右。电流在1~3ms内达到高峰,其激活和失活过程均呈电压和时间依赖性。该电流能被30μmol/L河豚毒素完全阻断,表明该电流为INa。该电流在破膜20min内无明显衰减现象。

钠外液溶解参松养心胶囊提取干粉配制成的0.5%溶液对INa有抑制作用(图1A~C)。用药前平均峰值电流密度为(27.2±5.4)pA/pF,用药后平均峰值电流密度为(14.9±2.8)pA/pF,平均抑制率为44.8%±7.7%(n=5,P<0.05)。药物在每一指令电压水平上均减小INa电流密度,但基本不改变激活电位、峰电位、反转电位和曲线的形状。给药后,在不同钳制电压下均使INa峰值电流受抑制,表现为电流密度―电压曲线上移(图1D)。

参松养心胶囊对豚鼠心肌细胞膜ICa,L的作用

使用ICa,L细胞内外液和ICa,L刺激方案在豚鼠和大鼠心室肌细胞上均能记录到一快速激活、缓慢失活的内向电流。从-30mV开始激活,峰值电位在0~+10mV,反转电位+50mV~+60mV。电流在10ms左右达到高峰,240ms基本完全失活。其激活和失活过程均呈电压和时间依赖性。该电流能被0.2mM的CdCl2完全阻断,表明该电流为ICa,L。此电流在20分钟内无明显衰减。

以测试电压为+10mV引出的ICa,L峰值电流作为观察指标。结果显示,参松养心胶囊药物溶液呈浓度依赖性抑制ICa,L峰值,将给药后ICa,L值与给药前ICa,L进行比较,各浓度组差异均有统计学意义(表)。图2A~C给出的是当药物浓度为0.5%时对ICa,L电流的影响。药物在每一指令电压水平上都减小ICa,L电流密度,但基本不改变激活电位、峰电位、反转电位和曲线的形状(图2D)。讨论

多种跨膜离子流的复杂变化产生心肌细胞的动作电位和静息电位,细胞膜离子通道电流的异常改变是形成心律失常的重要因素。膜片钳技术可直接测定膜离子通道电流的大小,是研究药物对离子通道活性影响的最为直接的手段。

本实验结果表明,参松养心胶囊对INa峰值电流有抑制作用,同时对ICa,L具有浓度依赖性阻滞作用。参松养心胶囊可使两种电流的电流密度―电压曲线均向上移,但不改变峰值、激活和反转电位,提示参松养心胶囊在不同膜电位水平对INa、ICa,L均具有一致的阻滞作用。

INa形成快反应动作电位的0相,可影响心肌兴奋性、不应性和传导性,抑制INa可能引起细胞自律性和传导性下降,发挥其抗心律失常作用。ICa,L是动作电位2相的主要离子流,对动作电位时程起重要作用,可触发细胞内钙释放并引起心肌收缩偶联。细胞内钙超载是心肌缺血再灌注损伤的中心环节,抑制心肌细胞L型钙通道是抗心律失常的重要机制,可减轻细胞内的钙超载,对心肌起保护作用。

参松养心胶囊是由多味中药组成的复方制剂,具有复杂的成分,对INa和ICa,L的抑制作用可能仅为其药理机制的一部分。

(本文摘自《中华医学杂志》2007年第87卷第14期)

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